Pathologie en Medische Biologie Transcript-analyse met behulp van nanoString

​Detectie van ALK, RET en ROS1 fusietranscripten en MET exon 14 skipping met behulp van nanoString analyse (30-05-2019).

Sinds maart 2019 wordt de analyse van genbreuken in longkanker in het UMCG in plaats van de gebruikelijke FISH uitgevoerd met behulp van de nanoString methode (UMCG  nS long_v1). Hiermee kan op RNA-niveau de aanwezigheid en de expressie van ALK, ROS1 en RET fusietranscripten in formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel in één analyse aangetoond worden. Daarnaast kunnen we met deze test MET exon 14 skipping events aantonen op RNA-niveau. Het voordeel van de analyse op RNA-niveau is dat er op deze manier bepaald kan worden of een genfusie of MET exon 14 skipping mutatie op DNA niveau daadwerkelijk ook tot expressie komt.

De analyse maakt gebruikt van fluorescent-gelabelde ‘imbalance probes’ die een breuk in ALK, ROS1 en RET kunnen aantonen (Figuur 1). Daarnaast wordt gebruik gemaakt van probes die specifiek gericht zijn tegen bekende, veel voorkomende genfusie producten (Tabel 1). Op deze manier kunnen we ook de fusie-partner betrouwbaar aantonen, mits het een van de bekende partners is. Dit geeft ten opzichte van DNA FISH een duidelijke meerwaarde omdat het aantonen van het specifieke fusieproduct mogelijk relevant kan zijn voor therapiekeuze. Indien een breuk in ALK, ROS1 of RET aanwezig is, maar de fusie-partner niet aangetoond kan worden, dan wordt dit vermeld als bijvoorbeeld “ROS1 fusietranscript positief niet nader gespecificeerd”. Samengevat kunnen we breuken aantonen voor bekende en onbekende fusietranscripten die belangrijk zijn voor therapiekeuze. Een bijkomend voordeel van de nanoString methode is dat het panel uitgebreid kan worden met nieuwe predictieve merkers zoals BRAF, NTRK1, NTRK2, NTRK3 en NGR1 fusietranscripten (dit panel wordt momenteel gevalideerd). Met één nanoString test kunnen dan 9 fusiegenen in één analyse bepaald worden in plaats van opeenvolgende FISH testen. Door de samenstelling van het nanoString panel is deze naast de moleculaire diagnostiek van het niet-kleincellig long carcinoom ook geschikt voor de diagnostiek van papillair schildkliercarcinoom en spitzoïde melanocytaire tumoren.

Voor de standaard moleculaire test t.b.v. de moleculaire diagnostiek van adenocarcinomen van de long, wordt vanaf 1 maart 2019 de nanoString analyse gelijktijdig uitgevoerd met de long DNA mutatie NGS analyse. In verband met een kortere doorlooptijd wordt er daarom niet gewacht op de NGS uitslag, tenzij daarover ander afspraken met de aanvrager gemaakt zijn. De uitslag van beide moleculaire testen wordt geïntegreerd in het pathologie verslag. Met de invoering van de nanoString analyse wordt er geen ROS1 en RET FISH meer uitgevoerd, ook niet wanneer de analyse niet uitgevoerd kan worden in verband met een te laag percentage tumorcellen (<20%), te lage RNA opbrengst (100 ng) of RNA afbraak. In gevallen met een te laag percentage tumorcellen (<20%), adviseren we om in overleg met de behandelaar een nieuw biopt af te nemen. Indien niet mogelijk, kunnen in overleg met de KMBP de eventuele alternatieve analyse methoden besproken worden.

Figuur 1: Principe voor het ontwerp van fusietranscript specifieke probes (A) en ‘imbalance probes’ (B). Referentie: J Mol Diagn. 2018;20(1): 63-77.

 

ALK 
(NM_004304)
ROS1 
(NM_002944)
RET
(NM_020975)
MET exon 14 skipping 
(NM_000245)
​EML4_13:ALK_20 CD74_6:ROS1_32 CCDC6_1:RET_12 METx13_15
​EML4_18:ALK_20 EZR_10:ROS1_34 KIF5B_15:RET_11 METx13_14
​EML4_2:ALK_20 GOPC_4:ROS1_36 KIF5B_15:RET_12 METx14_15
​EML4_20:ALK_20 GOPC_7:ROS1_35 KIF5B_16:RET_12  
EML4_6:ALK_19 GOPC_8:ROS1_35 KIF5B_22:RET_12  
EML4_6a:ALK_20 LRIG3_16:ROS1_35 KIF5B_23:RET_12  
EML4_6b:ALK_20 SDC4_2:ROS1_32 KIF5B_24:RET_11  
HIP1_21:ALK_20 SDC4_4:ROS1_34 KIF5B_24:RET_8  
HIP1_28:ALK_20 SLC34A2_13-:ROS1_32    
KIF5B_17:ALK_20 ​SLC34A2_4:ROS1_32
KIF5B_24:ALK_20 ​SLC34A2_4:ROS1_34
TFG_5:ALK_20 ​TPM3_8:ROS1_35
TPR_15:ALK_20      
       
ALK 5p-1 ROS1 5p-1 RET 5p-1  
ALK 5p-2 ROS1 5p-2 RET 5p-2  
ALK 5p-3 ​ROS1 5p-3 ​RET 5p-3
ALK 5p-4 ROS1 5p-4 RET 5p-4  
ALK 3p-1 ROS1 3p-1 RET 3p-1  
ALK 3p-2 ROS1 3p-2 RET 3p-2  
ALK 3p-3 ROS1 3p-3 RET 3p-3  
ALK 3p-4 ​ROS1 3p-4 ​RET 3p-4

Tabel 1: Fusietranscript specifieke probes en ‘imbalance probes’, UMCG  nS long_v1 (1 maart 2019)

Indien in een sample alleen een onbalans in de 3’/5’ ratio wordt gevonden zonder een signaal voor een fusietranscript-specifieke probe, dan wordt de bevinding gerapporteerd als ‘GEN fusietranscript positief, niet nader gespecificeerd’.