Doel: Bepalen van relatieve en absolute aantallen van de verschillende lymfocytenpopulaties in perifeer bloed en beenmerg.
Vereiste klinische informatie: Op het aanvraagformulier dient de standaardinformatie (identificatie, geboortedatum, geslacht) te zijn ingevuld. Daarnaast is vermelding van de klinische verdenking essentieel.
Beschrijving methodes: Voor de lymfocytensubtypering wordt de volbloed methode gebruikt. Hiervoor wordt een kleine hoeveelheid onbewerkt bloed of beenmerg in buisjes gepipetteerd. Aan elk buisje worden monoklonale antistoffen toegevoegd welke met een fluorochroom gelabeld zijn. Door het gebruik van verschillende fluorochromen (fluoresceine-isothiocyanaat (FITC); phyco-erythrin (PE); PE-cyanine 5, PE-Cy5; PerCP; APC; etc.) kunnen meerdere antistoffen per buisje worden toegevoegd, meestal drie à vier verschillende. Na incubatie worden de cellen gewassen en de erytrocyten gelyseerd. De verkregen celsuspensies worden gemeten met de flowcytometer. In de flowcytometer passeren de cellen één of meerdere laserstralen die de fluorochromen aanslaan (excitatie), zodat ze licht met een langere golflengte uitzenden (emissie). Dit fluorescentielicht wordt vervolgens gemeten en gecombineerd met gegevens over de lichtverstrooiing van dezelfde cel. De voorwaartse lichtverstrooiing (FCS) is een maat voor de grootte van de cellen, terwijl de zijwaartse lichtverstrooiing (SSC) een maat is voor de onregelmatigheid van de cel (onregelmatige vorm van de cel of van de kernen, en het voorkomen van granules). Op basis van voorwaartse en zijwaartse lichtverstrooiing kan de lymfocytenpopulatie duidelijk worden onderscheiden van de andere leukocyten in het bloed of beenmerg, zoals granulocyten en monocyten.
Tijdens het meten van perifeer bloedcellen op de flowcytometer zal standaard een celdifferentiatie worden uitgevoerd. Deze celdifferentiatie in combinatie met een separate nauwkeurige leukocytentelling maakt het mogelijk om absolute aantallen van de lymfocyten en hun subpopulaties te berekenen. Echter de bovengenoemde �??single platform�?? technieken maken een separate leukocytentelling overbodig.
Belasting voor de patiënt
Venapunctie of beenmergpunctie.
Voorbereiding patiënt
Geen specifieke voorbereiding nodig. De lymfocytentypering dient bij voorkeur op de dag van celmonsterafname plaats te vinden. Dit betekent dat de celmonsterafname bij voorkeur in de ochtend dient te gebeuren.
Materiaalafname/Fixatie
Afname van ongeveer 5 ml bloed middels venapunctie of 2 ml beenmerg middels een beenmergpunctie in een lithium-heparine buis. Het celmateriaal dient op kamertemperatuur te worden bewaard en verstuurd.
Stoorfactoren
Het wordt aanbevolen het immunofenotyperingsonderzoek in een klinisch stabiele periode uit te voeren, omdat infecties en immuunsuppresieve medicamenten veranderingen in lymfocytensubpopulaties kunnen veroorzaken.
Mogelijke toepassingen:
Het uitvoeren van lymfocytensubtypering is zinvol bij verdenking op:
- ongebruikelijke infectieproblematiek;
- immunodeficiëntie;
- HIV-infectie;
- lymfoproliferatieve ziekten, zoals leukemie, lymfomen en multipel myeloom.
Interpretatie: Het merendeel van de leukocyten in de verschillende stadia van de hematopoëse kan morfologisch worden herkend, maar met behulp van immunofenotypering is het mogelijk om deze cellen nader te karakteriseren. Hierbij wordt met antistoffen de expressie van leukocytenantigenen ofwel immunologische markers aangetoond; dit zijn eiwitten, al of niet voorzien van suikergroepen, die op de celmembraan tot expressie worden gebracht of intracellulair voorkomen. De laatste 25 jaar werden vele monoklonale antistoffen tegen leukocytenantigenen ontwikkeld. Deze antistoffen zijn voor een groot deel ingedeeld in antistofclusters, gebaseerd op reactiviteit met hetzelfde leukocytenantigeen. Deze clusters zijn voorzien van een eigen code: de CD (�??cluster of differentiation�??) code. Tijdens de differentiatie van onrijpe stamcel tot rijpe B- of T-lymfocyt komen verschillende combinaties van CD-antigenen tot expressie waarbij elk rijpingsstadium zijn eigen specifieke combinatie kent. Door hier gebruik van te maken kunnen met behulp van monoklonaal antistoffen de verschillende soorten lymfocyten worden onderscheiden.
Tegenwoordig wordt hiervoor de zogenaamde �??volbloed�?? methode gebruikt, dat wil zeggen zonder voorafgaande celscheidingen. In combinatie met het leukocytenaantal en de elektronische celdifferentiatie, kunnen tevens voor de lymfocytensubpopulaties in perifeer bloed de absolute aantallen worden berekend. Het verdient echter de voorkeur om de recent ontwikkelde �??single platform�?? technieken te gebruiken, omdat hiermee direct de absolute aantallen leukocyten en hun subpopulaties kunnen worden bepaald, zodat geen extra variaties ontstaan ten gevolge van omrekeningen. De �??single platform�?? techniek is gebaseerd op het toevoegen van een vast aantal meetbare bolletjes per volume-eenheid.
Uit onderzoek naar de omvang van de lymfocytensubpopulaties op de kinderleeftijd blijkt dat zowel de relatieve als absolute aantallen lymfocytenpopulaties grote variaties kunnen vertonen, die o.a. gerelateerd zijn aan de leeftijd. Het is daarom van groot belang om leeftijdsgerelateerde referentiewaarden te gebruiken voor de interpretatie van de verkregen resultaten (tabel 1 en 2). Tevens blijkt dat de relatieve verdeling van de lymfocytenpopulaties geen afspiegeling zijn van hun werkelijke omvang. Interpretaties van immunofenotyperingsdata kunnen daarom beter plaatsvinden op basis van absolute aantallen (tabel 2 en figuur 1).
Figuur 1: Absolute aantallen naar leeftijd 
Lymfocytensubtypering bij ongebruikelijke infectieproblematiek en immunodeficiënties
Beknopte evaluatie van de lymfocyten kan worden verkregen door labeling met de volgende antistoffen: CD19 (B-lymfocyten), CD3/CD4/CD8 (T-lymfocyten), en CD16/CD56 (NK-cellen). Al naar gelang de aard van de klachten kunnen de labelingen worden uitgebreid met monoklonale antistoffen om specifieke moleculen aan te tonen. Hierbij kan men denken aan bijvoorbeeld: CD45RA en CD45RO expressie op T-lymfocyten die een indicatie zijn voor de rijpheid van de cellen; activatiemoleculen zoals CD22 (activatie van B-cellen) én CD100 (activatie van lymfocyten); adhesiemoleculen en HLA moleculen; HLA-molecuul receptoren zoals CD4 en CD8 op T-lymfocyten, CD74 op B-lymfocyten, en CD94, CD158, en CD161 op NK-cellen; Fc-receptoren; cytokine receptoren; moleculen die een rol spelen in de apoptose, zoals bijvoorbeeld CD95.
Lymfocytensubtypering bij HIV-infectie
Infectie met HIV wordt veelal gekenmerkt door een geleidelijke �??afbraak�?? van het immuunsysteem, hetgeen uiteindelijk zal leiden tot het klinische beeld �??acquired immunodeficiency disease�?? (AIDS). In het eerste stadium van de HIV infectie, de acuut syndroom fase, zullen met name de CD4+ T-lymfocyten verlaagd aanwezig zijn. In de asymptomatische fase vindt een verdere daling plaats van de CD4+ T-lymfocyten, terwijl gelijktijdig een stijging van CD8+ T-lymfocyten kan worden waargenomen.
Lymfocytensubtypering bij lymfoproliferatieve ziekten
Leukemieën en lymfomen kunnen worden beschouwd als de maligne tegenpolen van cellen in de verschillende hematopoëtische differentiatiestadia. Immunofenotypering is bij uitstek geschikt om de differentiatiestadia van hematopoëtische cellen te onderzoeken en is daarom bruikbaar om het differentiatiestadium of, indien aanwezig, de verschillende differentiatiestadia van een hematopoëtische maligniteit te bepalen. Hierbij moet worden opgemerkt dat het immunofenotype van leukemieën en maligne lymfomen niet identiek hoeft te zijn aan dat van normale hematopoëtische cellen. Vaak worden verschillen gevonden, die juist kunnen worden gebruikt om de afwijkende maligne cellen te onderscheiden van normale hematopoëtische cellen. Desalniettemin geeft het vergelijken met normale hematopoëtische cellen een zeer bruikbaar houvast betreffende het differentiatiestadium van een leukemie of maligne lymfoom.
In het algemeen kan worden gesteld dat acute leukemieën de maligne tegenpolen zijn van cellen in onrijpe differentiatiestadia. Bij chronische leukemieën en de meeste lymfomen is het maturatiearrest vooral gelokaliseerd in rijpere differentiatiestadia. Het multipel myeloom wordt beschouwd als de maligne tegenpool van de rijpere cel uit de B-celdifferentiatiereeks, namelijk de plasmacel.
Klonaliteitsdiagnostiek
De diagnostiek van rijpe lymfatische maligniteiten kan worden ondersteund door klonaliteitsdiagnostiek, gebaseerd op het feit dat alle cellen van een maligniteit afkomstig zijn van één kwaadaardig getransformeerde cel en dus een klonale oorsprong hebben. Onderscheid tussen monoklonaliteit (afstamming van één cel) en polyklonaliteit (afstamming van vele verschillende cellen) kan in geval van rijpe B-cellen worden gemaakt op basis van immunoglobuline lichte keten expressie: Igk of Igl. De normale Igk/Igl ratio varieert tussen 0,8 en 2,5, maar in geval van een B-celmaligniteit (B-celleukemie, B-cellymfoom, of multipel myeloom) zal slechts één Ig lichte keten tot expressie worden gebracht, zodat een sterk verstoorde Igk/Igl ratio zal worden gevonden. De Igk/Igl ratio kan op eenvoudige wijze worden vastgesteld door middel van drie- of viervoudige labelingen.
Recent is het ook mogelijk geworden om de klonale oorsprong van rijpe T-cellen te onderzoeken. Dit is vooral toepasbaar bij T-celmaligniteiten, die de zogenoemde T-celreceptor ab (TCRab) tot expressie brengen. Op dit moment zijn 24 verschillende antistoffen beschikbaar waarmee het merendeel van de variabele (V) domeinen van de TCRb-ketens kan worden herkend. Viervoudige labelingen met deze Vb antistoffen maken snel klonaliteitsonderzoek van verdachte T-celpopulaties mogelijk.
Valkuilen: Men moet er op bedacht zijn dat bij immunofenotyperingsonderzoek in het bloed van pasgeborenen en in navelstrengbloed de lysis van erytrocyten zeer moeizaam verloopt en dus onvolledig kan zijn. In dat geval dient een extra labeling te worden toegevoegd, de zogenaamde CD71/GpA/CD45 labeling. Met deze labeling kunnen ongelyseerde en onrijpe erytrocyten worden aangetoond.
Tabel 1: Relatieve omvang van de belangrijkste lymfocyten-subpopulaties in bloed.a
Lymfocytensubpopulaties
|
|
|
|
|
Leeftijdsgroepen
|
|
Neonataal
(n=35)
|
1 w-2mb
(n=13)
|
2-5m
(n=46)
|
5-9m
n=105)
|
9-15m
(n=70)
|
15-24m
(n=33)
|
2-5j
(n=33)
|
5-10j
(n=35)
|
10-16j
(n=23)
|
volw
(n=51)
|
CD19+ B-lymfocyten
|
12%
(7-22)
(6-26)
|
15%
(7-23)
|
24%
(15-36)
(14-39)
|
21%
(15-33)
(13-35)
|
25%
(17-36)
(15-39)
|
28%
(20-38)
(17-41)
|
24%
(16-31)
(14-44)
|
18%
(12-26)
(10-31)
|
16%
(9-22)
(8-24)
|
12%
(8-18)
(6-19)
|
CD3+ T-lymfocyten
|
58%
(43-76)
(35-80)
|
72%
(62-82)
|
63%
(55-73)
(48-75)
|
66%
(56-74)
(50-77)
|
65%
(55-74)
(54-76)
|
64%
(53-71)
(39-73)
|
64%
(56-73)
(43-76)
|
69%
(57-76)
(55-78)
|
67%
(55-77)
(52-78)
|
72%
(59-83)
(55-83)
|
CD3+/CD4+ T-lymfocyten
|
41%
(25-56)
(22-66)
|
55%
(44-65)
|
45%
(36-54)
(33-58)
|
45%
(37-55)
(33-58)
|
44%
(35-52)
(31-54)
|
41%
(27-49)
(25-50)
|
37%
(26-47)
(23-48)
|
35%
(29-46)
(27-53)
|
39%
(27-48)
(25-48)
|
44%
(31-55)
(28-57)
|
CD3+/CD8+ T-lymfocyten
|
19%
(12-28)
(11-33)
|
16%
(11-22)
|
17%
(12-23)
(11-25)
|
18%
(14-24)
(13-26)
|
18%
(13-25)
(12-28)
|
20%
(13-28)
(11-32)
|
24%
(18-30)
(14-33)
|
28%
(19-34)
(19-34)
|
23%
(13-33)
(9-35)
|
24%
(16-32)
(10-39)
|
CD4/CD8 ratio per CD3+
|
2,2
(1,3-3,2)
(1,1-3,9)
|
3,8
(1,8-5,8)
|
2,7
(1,8-3,8)
(1,7-3,9)
|
2,5
(1,7-3,5)
(1,6-3,8)
|
2,4
(1,5-3,4)
(1,3-3,9)
|
1,9
(1,2-3,1)
(0,9-3,7)
|
1,6
(1,1-2,6)
(0,9-2,9)
|
1,2
(0,9-1,9)
(0,9-2,6)
|
1,7
(0,9-3,3)
(0,9-3,4)
|
1,9
(1,1-3,2)
(1,0-3,6)
|
TCRαβ per CD3+ cellen
|
95%
(92-98)
(91-98)
|
96%
(94-99)
|
95%
(93-97)
(92-97)
|
96%
(93-97)
(92-98)
|
94%
(90-97)
(89-97)
|
91%
(87-95)
(82-96)
|
91%
(87-95)
(85-97)
|
90%
(78-94)
(74-95)
|
90%
(83-93)
(82-96)
|
94%
(85-98)
(81-98)
|
TCRγδ per CD3+ cellen
|
3%
(2-6)
(1-7)
|
3%
(0,8-5)
|
4%
(2-6)
(2-7)
|
4%
(3-7)
(2-8)
|
5%
(3-9)
(2-10)
|
7%
(3-10)
(2-13)
|
9%
(5-12)
(3-14)
|
9%
(6-18)
(4-22)
|
8%
(3-14)
(2-15)
|
5%
(2-14)
(1-18)
|
CD3-/CD16.56+ NK-cellen
|
19%
(7-29)
(5-43)
|
8%
(4-18)
|
6%
(3-10)
(2-14)
|
5%
(3-11)
(2-13)
|
7%
(4-14)
(3-17)
|
8%
(3-14)
(3-16)
|
10%
(4-16)
(4-23)
|
12%
(6-21)
(4-26)
|
15%
(7-26)
(6-27)
|
13%
(9-24)
(7-31)
|
a. De relatieve frequenties zijn weergegeven binnen de lymfocytenpopulatie: dit betreft de meridiaan en tussen haakjes de 10 tot 90 en 5 tot 95 percentielen.
b. Voor de 1w-2m leeftijdsgroep zijn de gemiddelde ±1,282 SD waarden weergegeven; deze waarden zijn vergelijkbaar met de 10 en 90 percentielen.
|
Tabel 2: Absolute omvang van de belangrijkste lymfocyten-subpopulaties in bloed.a
Lymfocytensubpopulaties
|
|
|
|
|
Leeftijdsgroepen
|
|
Neonataal
(n=35)
|
1 w-2mb
(n=13)
|
2-5m
(n=46)
|
5-9m
n=105)
|
9-15m
(n=70)
|
15-24m
(n=33)
|
2-5j
(n=33)
|
5-10j
(n=35)
|
10-16j
(n=23)
|
volw
(n=51)
|
Lymfocyten
|
4,1
(2,2-6,9)
(1,8-7,4)
|
6,7
(4,0-11,3)
|
5,9
(3,9-8,6)
(3,7-9,6)
|
6,0
(4,0-9,0)
(3,8-9,9)
|
5,5
(3,1-8,7)
(2,6-10,4)
|
5,6
(3,4-8,9)
(2,7-11,9)
|
3,3
(2,3-5,6)
(1,7-6,9)
|
2,8
(1,6-4,3)
(1,1-5,9)
|
2,2
(1,3-3,0)
(1,0-5,3)
|
1,8
(1,1-2,5)
(1,0-2,8)
|
CD19+ B-lymfocyten
|
0,5
(0,2-1,0)
(0,1-1,1)
|
1,0
(0,3-1,7)
|
1,3
(0,8-2,6)
(0,6-3,0)
|
1,3
(0,8-2,2)
(0,7-2,5)
|
1,4
(0,7-2,4)
(0,6-2,7)
|
1,3
(0,9-2,5)
(0,6-3,1)
|
0,8
(0,4-1,5)
(0,2-2,1)
|
0,5
(0,3-0,7)
(0,2-1,6)
|
0,3
(0,2-0,5)
(0,2-0,6)
|
0,2
(0,1-0,4)
(0,1-0,5)
|
CD3+ T-lymfocyten
|
4,6
(1,1-4,2)
(0,8-4,9)
|
3,6
(2,8-6,5)
|
3,8
(2,4-5,6)
(2,3-6,5)
|
3,4
(2,7-6,1)
(2,4-6,9)
|
3,5
(1,8-5,9)
(1,6-6,7)
|
2,3
(2,2-5,5)
(1,4-8,0)
|
1,9
(1,4-3,6)
(0,9-4,5)
|
1,5
(1,1-2,8)
(0,7-4,2)
|
1,2
(1,0-2,0)
(0,8-3,5)
|
2,5
(0,7-1,9)
(0,7-2,1)
|
CD3+/CD4+ T-lymfocyten
|
1,8
(0,8-2,9)
(0,5-3,4)
|
3,5
(2,1-4,9)
|
2,5
(1,6-4,2)
(1,5-5,0)
|
2,8
(1,7-4,1)
(1,4-5,1)
|
2,3
(1,3-4,1)
(1,0-4,6)
|
2,2
(1,1-3,6)
(0,9-5,5)
|
1,3
(0,7-2,0)
(0,5-2,4)
|
1,0
(0,5-1,3)
(0,3-2,0)
|
0,8
(0,5-1,3)
(0,4-2,1)
|
0,7
(0,4-1,3)
(0,3-1,4)
|
CD3+/CD8+ T-lymfocyten
|
0,8
(0,3-1,8)
(0,2-1,9)
|
1,0
(0,5-1,6)
|
1,0
(0,7-1,5)
(0,5-1,6)
|
1,1
(0,7-1,8)
(0,6-2,2)
|
1,1
(0,5-1,8)
(0,4-2,3)
|
1,2
(0,5-1,8)
(0,4-2,3)
|
0,8
(0,5-1,4)
(0,3-1,6)
|
0,8
(0,4-1,2)
(0,3-1,8)
|
0,4
(0,3-0,8)
(0,2-1,2)
|
0,4
(0,2-0,7)
(0,2-0,9)
|
CD3+/TCRαβ+ T-lymfocyten
|
2,4
(1,1-4,0)
(0,8-4,7)
|
4,4
(2,6-6,2)
|
3,2
(2,2-5,3)
(2,1-6,3)
|
3,5
(2,5-5,9)
(2,1-6,6)
|
3,3
(1,7-5,5)
(1,5-6,4)
|
3,2
(2,0-5,4)
(1,2-7,5)
|
2,1
(1,4-3,6)
(1,1-4,4)
|
1,6
(1,0-2,6)
(0,8-3,5)
|
1,3
(0,8-1,8)
(0,7-2,9)
|
1,2
(0,7-1,8)
(0,6-2,0)
|
CD3+/TCRγδ T-lymfocyten
|
0,06
(0,03-0,2)
(0,02-0,3)
|
0,1
(0,02-0,2)
|
0,1
(0,08-0,3)
(0,06-0,3)
|
0,2
(0,09-0,3)
(0,08-0,4)
|
0,2
(0,09-0,3)
(0,05-0,5)
|
0,3
(0,08-0,5)
(0,06-0,8)
|
0,2
(0,1-0,3)
(0,08-0,3)
|
0,2
(0,07-0,5)
(0,06-0,6)
|
0,1
(0,04-0,2)
(0,04-0,2)
|
0,06
(0,02-0,2)
(0,02-0,2)
|
CD3-/CD16.56+ NK-cellen
|
0,8
(0,2-1,8)
(0,1-1,9)
|
0,5
(0,3-0,8)
|
0,3
(0,2-0,9)
(0,1-1,3)
|
0,3
(0,2-0,8)
(0,1-1,0)
|
0,4
(0,2-0,9)
(0,2-1,2)
|
0,4
(0,1-1,1)
(0,1-1,4)
|
0,4
(0,1-0,7)
(0,1-1,0)
|
0,3
(0,1-0,6)
(0,09-0,9)
|
0,3
(0,1-0,7)
(0,07-1,2)
|
0,3
(0,1-0,4)
(0,09-0,6)
|
a. Absolute aantallen (x 109/l); voor de meeste groepen is de meridiaan weergegeven en tussen haakjes de 10 tot 90 en 5 tot 95 percentielen.
b. Voor de 1w-2m leeftijdsgroep zijn de gemiddelde ±1,282 SD waarden weergegeven; deze waarden zijn vergelijkbaar met de 10 en 90 percentielen.
|
Vergelijking andere methodes: De uitkomsten van het immunofenotyperingsonderzoek dienen altijd te worden geïnterpreteerd in samenhang met de klinische gegevens. Met behulp van cytomorfologisch onderzoek kan ook globaal inzicht worden verkregen betreffende de aanwezige celpopulaties, maar dankzij de vele monoklonale antistoffen en de toepassing van drie- en viervoudige labelingen, kunnen op zeer nauwkeurige wijze subpopulaties worden gekarakteriseerd, die met cytomorfologische technieken niet te onderscheiden zijn.
Tarief (excl. ordertarief): Eerste antistof �?� 16,63, elke volgende antistof �?� 3,88.
Literatuur:
Achtergrondinformatie
- Comans-Bitter WM, Groot R de, Beemd R van den, et al. Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood: Reference values for lymphocyte subpopulations. J Pediatr 1997; 130: 388-93
.
- Dongen JJM van, Hooijkaas H (eds). Flowcytometrische immunodiagnostiek: Nieuwe ontwikkelingen en hun toepassingen. Rotterdam: Erasmus Universiteit Rotterdam/Academisch Ziekenhuis, 1998
.
- Langerak AW, Beemd R van den, Wolvers-Tettero ILM, et al. Molecular flow cytometric analysis of the Vb repertoire for clonality assessment in mature TCRab T-cell proliferations. Blood 2001; 98: 165-73
.
- Vries E de, Bruin-Versteeg S de, Comans-Bitter WM, et al. Correction for erythroid cell contamination in microassay for immunophenotyping of neonatal lymphocyte. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 1999; 80: F226-9
.
- Vries E de, Kuijpers TW, Tol MJD van, et al. Immunologie in de medische praktijk. XXXIV. Diagnostiek bij vermoeden van een afweerstoornis: inleiding. Ned Tijdschr Geneeskd 2000; 144: 2192-6
.
|
)window.location='http://www.dk.cvz.nl/images/tekeningen/groot/lymfocytensubtypering.gif')