| |
Doel: Onderzoek naar de eventuele aanwezigheid van bepaalde moleculaire markers (chromosoomafwijkingen) bij patiënten met de diagnose leukemie en/of lymfoom, teneinde tot een betere classificatie van het type leukemie/lymfoom te komen.
Vereiste klinische informatie: Op het aanvraagformulier dient de standaardinformatie (identificatie, geboortedatum, geslacht) te zijn ingevuld. Daarnaast is vermelding van de klinische verdenking essentieel en is vermelding van cyto-/histomorfologische gegevens en immunofenotype (lymfocytensubtypering) zeer gewenst.
Beschrijving methodes: Chromosoomafwijkingen kunnen met verschillende moleculaire technieken worden aangetoond, waaronder (RT-)PCR analyse, FISH en in beperkte mate �??Southern blot�?? analyse.
(RT-)PCR analyse
Chromosoomafwijkingen die aanleiding geven tot fusietranscripten, zoals t(9;22), kunnen eenvoudig worden aangetoond via PCR amplificatie van cDNA dat vanuit mRNA is gevormd (RT-PCR). Door in elk van beide genen een primer te kiezen in één van de exonen die aanwezig is in het uiteindelijke fusietranscript, is het mogelijk om het betreffende fusietranscript specifiek aan te tonen via agarose gel-elektroforese.1
Chromosoomafwijkingen waarbij geen fusiegen ontstaat, zoals t(14;18), kunnen doorgaans niet via RT-PCR analyse worden aangetoond. Desondanks kan een aanzienlijk gedeelte van dergelijke chromosoomafwijkingen wel op DNA niveau via PCR analyse worden aangetoond. Weliswaar kan de precieze positie van de breukpunten in de twee betrokken genen van patiënt tot patiënt verschillen, maar veelal is er sprake van clustering in één of enkele breukpuntgebieden. Op basis van deze clustering kunnen primers worden ontwikkeld, die respectievelijk de voor- en achterkant van het uiteindelijke breukpuntfusiegebied herkennen.
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
Een andere methode om chromosoomafwijkingen aan te tonen is FISH. In de traditionele FISH benadering worden twee fluorescent gelabelde probes gebruikt die elk een gebied in de twee betrokken genen herkennen. In een normale cel zullen de twee fluorescentiesignalen van beide probes apart te zien zijn, maar in geval van een chromosoomafwijking zullen de beide signalen samenvallen (co-lokalisatie). Deze benadering heeft echter het risico van fout-positiviteit door schijnbare co-lokalisatie ten gevolge van analyse van de driedimensionale structuur van de cel in een tweedimensionaal vlak. Om die reden is de alternatieve benadering van �??split-signal�?? FISH ontwikkeld.2 Bij �??split-signal�?? FISH herkennen de FISH probes DNA sequenties aan weerszijden van het breukpuntgebied in één van de twee betrokken genen. In geval van een normale cel zullen twee fusiesignalen van de twee normale allelen zichtbaar zijn, maar in geval van een chromosoomafwijking met een breuk in het betreffende gen zal één gesplitst signaal ontstaan naast één normaal fusiesignaal. Deze benadering heeft als belangrijk bijkomend voordeel dat chromosoomafwijkingen onafhankelijk van het betrokken partner-gen kunnen worden aangetoond.
�??Southern blot�?? analyse
�??Southern blot�?? analyse (agarose gel-elektroforese van met behulp van restrictie enzymen geknipt DNA, blotting naar een membraan, hybridisatie met een specifieke gelabelde probe van restrictiefragmenten van verschillende grootte) levert slechts een zeer beperkte bijdrage aan het aantonen van chromosoomafwijkingen.
Mogelijke toepassingen:
Toepassing van deze bepalingen ligt in de moleculaire classificatie van leukemieën en lymfomen, met name in gevallen waar cyto-/histomorfologisch onderzoek en immunologisch onderzoek naar eiwitprodukten van de chromosoomafwijkingen onvoldoende zekerheid bieden over het (sub)type leukemie of lymfoom. Aangezien de bestudeerde chromosoomafwijkingen veelal direct verbonden zijn met het oncogenetische proces, hebben ze veelal directe betekenis voor de prognose en behandeling van de betreffende leukemie of het lymfoom. Tenslotte kunnen de chromosoomafwijkingen ook als moleculaire markers worden gebruikt ten behoeve van follow-up analyse van leukemieën en lymfomen.
Interpretatie: Numerieke en structurele afwijkingen
Er bestaan twee hoofdgroepen chromosoomafwijkingen: de numerieke chromosoomafwijkingen (meer of minder chromosomen dan normaal) en de structurele chromosoomafwijkingen, zoals translocaties, inversies of deleties, waarbij gedeelten van chromosomen respectievelijk zijn uitgewisseld, omgekeerd of gelaedeerd. Deze structurele afwijkingen ontstaan door de gelijktijdige aanwezigheid van twee breukpunten in één of meerdere chromosomen, welke op een onjuiste wijze worden hersteld. Dit kan er uiteindelijk toe leiden dat twee genen op een foutieve manier aan elkaar worden gekoppeld.3
Chromosoomafwijkingen
Er wordt onderscheid gemaakt in twee typen foutieve genkoppelingen. In het eerste geval zijn twee genen zodanig aan elkaar gekoppeld dat een fusiegen ontstaat, dat wordt afgeschreven tot een fusietranscript en wordt vertaald in een fusie-eiwit. Ondanks het feit dat de exacte breukpunten tussen patiënten kunnen verschillen, zal in de meeste gevallen met een vergelijkbaar fusiegen hetzelfde fusie-eiwit ontstaan. Een voorbeeld is de translocatie van de chromosomen 9 en 22 (t(9;22)) waarbij het BCR-ABL fusietranscript wordt gevormd dat leidt tot een fusie-eiwit dat een rol speelt in de signaleringsroutes van de tumorcel.1,3
In het tweede geval vindt ook een foutieve koppeling van twee genen plaats, maar dit leidt vervolgens tot ontregeling van de expressie van het ene gen doordat een regulerend element (bv. �??enhancer�??) van het andere gen in de directe omgeving komt te liggen. Bij de t(14;18) komt de �??enhancer�?? van het IGH gen in de buurt van het BCL2 gen te liggen en ontregelt daardoor de expressie van dit gen, hetgeen leidt tot overexpressie van het anti-apoptotische BCL2 eiwit.3
Sensitiviteit/Specificiteit
In principe is bij een juiste primerkeuze (RT-)PCR analyse een zeer specifieke methode om chromosoomafwijkingen aan te tonen. De breukpuntgebieden kunnen op DNA-niveau bij bepaalde chromosoomafwijkingen echter behoorlijk groot zijn. Om die reden is het vaak noodzakelijk om meerdere PCR primer sets te ontwerpen om alle chromosoomafwijkingen van een bepaald type te kunnen aantonen. Toch kan het voorkomen dat bij bepaalde patiënten met een bepaalde primer set ook dan geen PCR product kan worden gevormd, omdat de afstand tussen primerpositie en breukpunt te groot is. Via (RT-)PCR kunnen chromosoomafwijkingen met een detectielimiet van ongeveer 10-3 tot 10-4 worden aangetoond.
De traditionele FISH benadering, met twee verschillend gekleurde probes in elk van beide betrokken genen, heeft als risico dat fout-positieve resultaten op kunnen treden ten gevolge van schijnbare co-lokalisatie van de probes. Bij de �??split-signal�?? FISH benadering, waarin beide FISH probes hetzelfde gen aan weerszijden van het breukpuntgebied herkennen, bestaat een dergelijk gevaar niet. De detectielimiet van FISH is in de orde van enkele procenten.
Valkuilen: Omdat PCR een zeer gevoelige techniek is, bestaat de kans op fout-positiviteit ten gevolge van contaminatie van (identieke) (RT-)PCR producten afkomstig van eerder onderzochte tumorcellen. Dit gevaar kan grotendeels worden ondervangen door een tweede (RT-)PCR uit te voeren op het onderzochte celmateriaal met een enigszins verschoven primer combinatie (zogenaamde �??shifted (RT-)PCR�??). Bij chromosoomafwijkingen waarbij de breukpunten in het DNA kunnen verschillen per patiënt, kan contaminatie relatief eenvoudig worden uitgesloten door de nucleotide sequentie van de gevonden PCR producten te analyseren.
Vergelijking andere methodes: Onderzoek naar chromosoomafwijkingen ten behoeve van classificatie van leukemieën en lymfomen kan ook worden uitgevoerd door middel van cytogenetische methodes (karyotypering). Voordeel van karyotypering is dat een totaal beeld van alle chromosoomafwijkingen wordt verkregen, inclusief bepaalde varianten die moeilijk of niet via moleculaire methoden zijn aan te tonen. Een belangrijk nadeel van karyotypering is echter dat metafases nodig zijn, de techniek veel tijdrovender is, maar vooral dat microdeleties en zogeheten cryptische translocaties onopgemerkt kunnen blijven.
Tarief (excl. ordertarief): �?� 33,25
Literatuur:
Referenties
- Dongen JJM van, Macintyre EA, Gabert JA, et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease: Report of the BIOMED-1 Concerted Action: Investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901-28
.
- Burg M van der, Beverloo HB, Langerak AW, et al. Rapid and sensitive detection of all types of MLL gene translocations with a single FISH probe set. Leukemia 1999; 13: 2107-13
.
- Langerak AW, Dongen JJM van. Moleculaire diagnostiek van lymfatische maligniteiten. In: Pelt-Verkuil E van, et al. (eds). Moleculaire diagnostiek. Houten: Bohn Stafleu Van Loghum, 2001: 191-215
.
|
|
