Klinisch doel:
Doel: De bepaling wordt gebruikt bij pati�nten
verdacht van een immuundefici�ntie, met
name in de T cel
functie. In deze assay wordt de T cel functionaliteit bepaald door
volbloed te stimuleren
met verschillende mitogenen en antigenen en T cel activatie en
cytokine productie te
meten. Op basis hiervan kunnen afwijkingen/defici�nties in T cel
functie gedetecteerd
worden.
Vereiste
klinische informatie: Op het
aanvraagformulier dient de standaardinformatie
(identificatie,
geboortedatum, geslacht) te zijn ingevuld. Daarnaast is vermelding van de
klinische verdenking
essentieel.
Achtergrond
informatie:
T cellen zijn een
belangrijke component van het adaptieve immuunsysteem en spelen
een essenti�le rol in
de bescherming tegen pathogenen. Na activatie door antigene
stimuli worden
allerlei activatiemarkers verhoogd tot expressie gebracht op het T cel
oppervlak (o.a. CD69)
en vindt er productie van verschillende cytokinen plaats (o.a IFN-
γ, TNF-α, IL-2, IL-4). Door de activatie status en het
cytokine profiel van T cellen te
analyseren kan het
vermogen van de T cellen om op verschillende stimuli te reageren
bepaald worden. Met
behulp van flowcytometrie kan de expressie van activatiemarkers
en intracellulaire
cytokinen zeer sensitief gemeten worden. Op deze manier kunnen
immuundefici�nties op
het gebied van T cel functie opgespoord worden.
Beschrijving
methode:
Aan volbloed van een
pati�nt worden verschillende mitogene en antigene stimuli
toegevoegd. Na
activatie door de verschillende stimuli worden allerlei activatiemarkers
verhoogd tot expressie
gebracht op het T cel oppervlak en vindt er productie van
verschillende
cytokinen plaats. Na 20 tot 24 uur kweken worden de samples
gelyseerd/gefixeerd/gepermeabiliseerd
en gelabeld met verschillende concentraties
Pacific
Blue (PB) en Pacific Orange (PO). Hierdoor laat ieder sample een uniek fluorescent
beeld zien. Vervolgens
worden de samples gewassen, weer samengevoegd in 1 buis en
gekleurd met fluorochroom-geconjugeerde
antilichamen. Het monster wordt gemeten op
de FACSCanto II en de
CD4+ en CD8+ T cellen worden geanalyseerd voor PB en PO
fluorescentie om te
kunnen herleiden met welk antigeen of mitogeen de cellen
gestimuleerd zijn. De
cellen in iedere gate worden geanalyseerd voor de expressie van de
activatie marker CD69
en de intracellulaire productie van IL-2, IFN-γ, TNF-α en IL-4.
Door de activatie
status en het cytokine profiel van T cellen te analyseren kan het
vermogen van de T
cellen om op verschillende stimuli te reageren bepaald worden en
kunnen afwijkingen en
defici�nties in T cel functie opgespoord worden (zie
referentiefiguur TFUN figuur).
Keuze van
stimuli:
T cellen kunnen
geactiveerd worden door een breed scala aan antigene en mitogene
stimuli. De activatie
door de verschillende stimuli loopt via verschillende routes in de T
cel. Om een zo breed
mogelijk scala aan defici�nties in T cel functie te kunnen detecteren
is het noodzakelijk om
de T cel respons op verschillende stimuli in kaart te brengen. Er is
daarom gekozen voor
een mitogene stimulus (PHA), directe activatie van het T cel
receptor complex
(anti-CD3), een superantigeen (Staphylococcal enterotoxin B) en twee
eiwit recall antigenen
(tetanus toxoid en purified protein derivative tuberculose). Het
functioneren van de T
cellen kan aan de hand van de responsen op deze stimuli goed in
kaart gebracht worden.
Keuze van
cytokines:
T cellen kunnen na
stimulatie een breed scala aan cytokines, chemokines en andere
factoren produceren.
Interleukin-2 (IL-2), interferon-gamma (IFN-γ) en tumor necrosis
factor-alpha (TNF-α) zijn Th1 cytokines die een belangrijke
rol spelen in de celgemedieerde
immuniteit. Behalve
deze drie cytokinen wordt ook de productie van de Th2
cytokine
interleukine-4 (IL-4) gemeten. IL-4 speelt een belangrijke rol bij de activatie
en
regulatie van de
humorale immuniteit.
Belasting voor
de pati�nt:
Venapunctie
Voorbereiding
pati�nt:
Geen specifieke
voorbereiding nodig. De T cel functie assay dient op de dag van
bloedafname plaats te
vinden. Dit betekent dat de bloedafname in de ochtend (voor 11
uur) dient te
gebeuren.
Materiaalafname/Fixatie:
Afname van minimaal 2
ml bloed middels venapunctie in een natrium-heparine buis. Het
celmateriaal dient op
kamertemperatuur te worden bewaard en verstuurd.
Stoorfactoren:
Het wordt aanbevolen
het T cel functie onderzoek in een klinisch stabiele periode uit te
voeren, omdat
infecties en immuunsuppresieve medicamenten veranderingen in T cel
functie kunnen
veroorzaken.
Mogelijke
toepassingen:
Het uitvoeren van de T
cel functie assay is zinvol bij verdenking op:
�
ongebruikelijke
infectieproblematiek;
�
immuundefici�ntie
Interpretatie:
Deze assay zal ingezet
worden bij patienten die verdacht worden van een T cel
immuundeficientie. Bij
gezonde personen worden, na activatie door antigene en mitogene
stimuli, allerlei
activatie markers verhoogd tot expressie gebracht op het T cel oppervlak
en vind er productie
van verschillende cytokinen plaats. Patienten met een T cel functie
defici�ntie zullen een
verminderde/afwezige respons laten zien na antigene en/of
mitogen stimulatie.
De resultaten van de
pati�nt worden ge�nterpreteerd door een medisch immunoloog op
basis van
referentiewaarden en van de resultaten van een, bij voorkeur op leeftijd
gematchte, gezonde
controle die gelijktijdig wordt ingezet. Bij afwijkende resultaten van
de pati�nt wordt,
indien mogelijk, de assay herhaald op een onafhankelijk bloedmonster
om de afwijkende
resultaten te bevestigen.
Valkuilen:
Aangezien er een
activatie/kweekstap in het protocol zit, is de variatie in uitkomst relatief
hoog wat de
interpretatie van de resultaten moeilijk kan maken. De resultaten zullen
daarom altijd
beoordeeld door de medisch immunoloog aan de hand van de
referentiewaarden en
de resultaten van een, bij voorkeur op leeftijd gematchte, gezonde
controle. Verder zal
bij afwijkende resultaten van de patient, indien mogelijk, de assay
herhaald worden op een
onafhankelijk bloedmonster om de afwijkende resultaten te
bevestigen.
Vergelijking
andere methodes:
De uitkomsten van de T
cel functie assay dienen altijd te worden ge�nterpreteerd in
samenhang met de
uitkomsten van de lymfocyten subset analyse en de klinische
gegevens.
Literatuur:
- Stam et al. Fluorescent
cell barcoding as a tool to assess the age-related
development
of intracellular cytokine production in small amounts of blood from
infants.
PLoS ONE (2011) 6(10):e25690
